Принципы структурной организации мембранных белков и способы ее предсказания для трансмембранных белков. Мембранные процессы. Плазматическая мембрана Мембранные белки - это амфифильные соединения

Если основная роль липидов в составе мемб­ран заключается в стабилизации бислоя, то бел­ки отвечают за функциональную активность мембран. Одни из них обеспечивают транспорт определённых молекул и ионов, другие явля­ются ферментами, третьи участвуют в связыва­нии цитоскелета с внеклеточным матриксом или служат рецепторами для гормонов, медиаторов,

эйкозаноидов, липопротеинов, оксида азота (N0). На долю белков приходится от 30 до 70% массы мембран. Белки определяют особеннос­ти функционирования каждой мембраны.

Особенности строения

и локализации белков в мембранах

Мембранные белки, контактирующие с гид­рофобной частью липидного бислоя, должны быть амфифильными. Те участки белка, кото­рые взаимодействуют с углеводородными цепя­ми жирных кислот, содержат преимущественно неполярные аминокислоты. Участки белка, на­ходящиеся в области полярных «головок», обо­гащены гидрофильными аминокислотными ос­татками.

Локализация белков в мембранах. Трансмембранные белки, например: 1 - гликофорин А; 2 - рецептор адреналина. Поверхностные белки: 3 - белки, связанные с интегральными белками, например, фермент сукцинатдегидрогеназа; 4 - белки, присоединенные к полярным «головкам» липидного слоя, например, протеинкинаэа С; 5 - бел­ки, -заякоренные» в мембране с помощью короткого гидрофобного концевого домена, например, цитохрои b 5 ;6 - «заякоренные» белки, ковалентно соединённые с пипидом мембраны (например, фермент щелочная фосфатаза).

Поверхностные белки

Поверхностные белки часто прикрепляются к мембране, взаимодействуя с интегральными

белками или поверхностными участками липидного слоя.

Белки, образующие комплексы с интеграль­ными белками мембраны

Ряд пищеварительных ферментов, участвую­щих в гидролизе крахмала и белков, прикреп­ляется к интегральным белкам мембран микро­ворсинок кишечника.

Примерами таких комплексов могут быть сахараза-изомальтаза и мальтаза-гликоамилаза.

Белки, связанные с полярными «головками» липидов мембран

Полярные или заряженные домены белковой молекулы могут взаимодействовать с полярны­ми «головками» липидов, образуя ионные и во­дородные связи. Кроме того, множество раство­римых в цитозоле белков при определённых условиях могут связываться с поверхностью мембраны на непродолжительное время. Иног­да связывание белка - необходимое условие проявления ферментативной активности. К та­ким белкам, например, относят протеинкиназу С, факторы свёртывания крови.

Закрепление с помощью мембранного «якоря»

«Якорем» может быть неполярный домен белка, построенный из аминокислот с гидро-

фобными радикалами. Примером такого белка может служить цитохром b 5 мембраны ЭР. Этот белок участвует в окислительно-восстанови­тельных реакциях, как переносчик электронов.

Роль мембранного «якоря» может выполнять также ковалентно связанный с белком остаток жирной кислоты (миристиновой - С 14 или пальмитиновой - С 16). Белки, связанные с жирными кислотами, локализованы в основном на внутренней поверхности плазматической мембраны. Миристиновая кислота присоединя­ется к N-концевому глицину с образованием амидной связи. Пальмитиновая кислота обра­зует тиоэфирную связь с цистеином или слож-ноэфирную с остатками серина и треонина.

Небольшая группа белков может взаимодей­ствовать с наружной поверхностью клетки с помощью ковалентно присоединённого к С-концу белка фосфатидилинозитолгликана. Этот «якорь» - часто единственное связующее зве­но между белком и мембраной, поэтому при действии фосфолипазы С этот белок отделяет­ся от мембраны.

Трансмембранные (интегральные) белки

Некоторые из трансмембранных белков про­низывают мембрану один раз (гликофорин), дру­гие имеют несколько участков (доменов), пос­ледовательно пересекающих бислой.

Трансмембранные домены, пронизывающие бислой, имеют конформацию α -спирали. Поляр­ные остатки аминокислот обращены внутрь глобулы, а неполярные контактируют с мембранны­ми липидами. Такие белки называют «вывернуты­ми» по сравнению с растворимыми в воде белка­ми, в которых большинство гидрофобных остатков аминокислот спрятано внутрь, а гидрофильные располагаются на поверхности.

Радикалы заряженных аминокислот в соста­ве этих доменов лишены заряда и протониро-ваны (-СООН) или депротонированы (-NH 2).

Гликозилированные белки

Поверхностные белки или домены интеграль­ных белков, расположенные на наружной по­верхности всех мембран, почти всегда гликози-лированы. Олигосахаридные Остатки могут быть присоединены через амидную группу аспараги-на или гидроксильные группы серина и треонина.

Олигосахаридные остатки защищают белок от протеолиза, участвуют в узнавании лигандов или адгезии.

Латеральная диффузия белков

Некоторые мембранные белки перемещают­ся вдоль бислоя (латеральная диффузия) или по­ворачиваются вокруг оси, перпендикулярно его поверхности.

Латеральная диффузия интегральных белков в мембране ограничена, это связано с их боль­шими размерами, взаимодействием с другими мембранными белками, элементами цитоскелета или внеклеточного матрикса.

Белки мембран не совершают перемещений с одной стороны мембраны на другую («флип-флоп» перескоки), подобно фосфолипидам.

Белки, связанные с полярными «головками» липидов мембран

Белки, образующие комплексы с интегральными белками мембраны

Поверхностные белки

Поверхностные белки часто прикрепляются к мембране, взаимодействуя с интегральными белками или поверхностными участками липидного слоя.

Ряд пищеварительных ферментов, участвующих в гидролизе крахмала и белков, прикрепляется к интегральным белкам мембран микроворсинок кишечника.

Примерами таких комплексов могут быть сахараза-изомальтаза и мальтаза-гликоамилаза. Возможно, связь этих пищеварительных ферментов с мембраной позволяет с высокой скоростью гидролизовать субстраты и усваивать продукты гидролиза клеткой.

Полярные или заряженные домены белковой молекулы могут взаимодействовать с полярными "головками" липидов, образуя ионные и водородные связи. Кроме того, множество растворимых в цитозоле белков при определённых условиях могут связываться с поверхностью мембраны на непродолжительное время. Иногда связывание белка необходимое условие проявления ферментативной активности. К таким белкам, например, относят протеинкиназу С, факторы свёртывания крови.

Закрепление с помощью мембранного "якоря"

"Якорем" может быть неполярный домен белка, построенный из аминокислот с гидрофобными радикалами. Примером такого белка может служить цитохром b 5 мембраны ЭР. Этот белок участвует в окислительно-восстановительных реакциях, как переносчик электронов.

Роль мембранного "якоря" может выполнять также ковалентно связанный с белком остаток жирной кислоты (миристиновой - С 14 или пальмитиновой - С 16). Белки, связанные с жирными кислотами, локализованы в основном на внутренней поверхности плазматической мембраны. Миристиновая кислота присоединяется к N-концевому глицину с образованием амидной связи. Пальмитиновая кислота образует тиоэфирную связь с цистеином или сложноэфирную с остатками серина и треонина.

Небольшая группа белков может взаимодействовать с наружной поверхностью клетки с помощью ковалентно присоединённого к С-концу белка фосфатидилинозитолгликана. Этот "якорь" - часто единственное связующее звено между белком и мембраной, поэтому при действии фосфолипазы С этот белок отделяется от мембраны.

Некоторые из трансмембранных белков пронизывают мембрану один раз (гликофорин), другие имеют несколько участков (доменов), последовательно пересекающих бислой.

Интегральные белки мембран, содержащие от 1 до 12 трансмембранных доменов. 1- рецептор ЛПНП; 2 - ГЛЮТ-1 - транспортёр глюкозы; 3 - рецептор инсулина; 4 - адренорецептор.

Трансмембранные домены, пронизывающие бислой, имеют конформацию α-спирали. Полярные остатки аминокислот обращены внутрь глобулы, а неполярные контактируют с мембранными липидами. Такие белки называют "вывернутыми" по сравнению с растворимыми в воде белками, в которых большинство гидрофобных остатков аминокислот спрятано внутрь, а гидрофильные располагаются на поверхности.

Липидам в составе мембран отводят, в первую очередь, структурные свойства - они создают бислой, или матрикс, в котором размещаются активные компоненты мембраны - белки. Именно белки придают разнообразным мембранам уникальность и обеспечивают специфические свойства. Многочисленные мембранные белки выполняют следующие основные функции: обусловливают перенос веществ через мембраны (транспортные функции), осуществляют катализ, обеспечивают процессы фото- и окислительного фосфорилирования, репликацию ДНК, трансляцию и модификацию белков, рецепцию сигналов и передачу нервного импульса и др.

Принято делить мембранные белки на 2 группы: интегральные (внутренние) и периферические (наружные). Критерием такого разделения служит степень прочности связывания белка с мембраной и, соответственно, степень жесткости обработки, необходимой для извлечения белка из мембраны. Так, периферические белки могут высвобождаться в раствор уже при промывке мембран буферными смесями с низкой ионной силой, низкими значениями рН в присутствии хелатирующих веществ, например этилендиаминотетраацетата (ЭДТА), связывающих двухвалентные катионы. Периферические белки выделяются из мембран при таких мягких условиях, поскольку связаны с головками липидов или с другими белками мембраны при помощи слабых электростатических взаимодействий, либо с помощью гидро-фобных взаимодействий - с хвостами липидов. Наоборот, интегральные белки представляют собой амфифильные молекулы, имеют на своей поверхности большие гидрофобные участки и располагаются внутри мембраны, поэтому для их извлечения требуется разрушить бислой. Для этих целей наиболее часто используют детергенты или органические растворители. Способы прикрепления белков к мембране довольно разнообразны (рис. 4.8).

Транспортные белки . Липидный бислой является непроницаемым барьером для большинства водорастворимых молекул и ионов, и их перенос через биомембраны зависит от деятельности транспортных белков. Можно выделить два основных типа этих белков: каналы (поры) и переносчики . Каналы представляют собой туннели, пересекающие мембрану, в которых места связывания транспортируемых веществ доступны на обеих поверхностях мембраны одновременно. Каналы в процессе транспорта веществ не претерпевают каких-либо конформационных изменений, их конформация меняется лишь при открывании и закрывании. Переносчики, наоборот, в процессе переноса веществ через мембрану изменяют свою конформацию. Причем в каждый конкретный момент времени место связывания переносимого вещества в переносчике доступно только на одной поверхности мембраны.

Каналы, в свою очередь, можно разделить на две основные группы: потенциалзависимые и регулируемые химически. Примером потенциалзависимого канала является Na + -канал, его работа регулируется изменением напряжения электрического поля. Иными словами, эти каналы открываются и закрываются в ответ на изменение трансмембранного потенциала . Химически регулируемые каналы

открываются и закрываются в ответ на связывание специфических химических агентов. Например, никотиновый ацетилхолиновый рецептор при связывании с ним нейромедиатора переходит в открытую конформацию и пропускает одновалентные катионы (подрадел 4.7 данной главы). Термины «пора» и «канал» обычно взаимозаменяемы, но под порой чаще понимают неселективные структуры, различающие вещества главным образом по размеру и пропускающие все достаточно малые молекулы. Под каналами чаще понимают ионные каналы. Скорость транспорта через открытый канал достигает 10 6 - 10 8 ионов в секунду.

Переносчики также можно разделить на 2 группы: пассивные и активные. С помощью пассивных переносчиков через мембрану осуществляется транспорт одного типа веществ. Пассивные переносчики задействованы в облегченной диффузии и лишь увеличивают поток вещества, осуществляемый по электрохимическому градиенту (например, перенос глюкозы через мембраны эритроцитов). Активные переносчики транспортируют вещества через мембрану с затратами энергии. Эти транспортные белки накапливают вещества на одной из сторон мембраны, перенося их против электрохимического градиента. Скорость транспорта с помощью переносчиков в очень сильной степени зависит от их типа и колеблется от 30 до 10 5 с -1 . Часто для обозначения отдельных переносчиков используют термины «пермеаза», «транслоказа», которые можно считать синонимами термина «переносчик».

Ферментные функции мембранных белков . В клеточных мембранах функционирует большое количество разнообразных ферментов. Одни из них локализуются в мембране, находя там подходящую среду для превращения гидрофобных соединений, другие благодаря участию мембран располагаются в них в строгой очередности, катализируя последовательные стадии жизненно важных процессов, третьи нуждаются в содействии липидов для стабилизации своей конформации и поддержания активности. В биомембранах обнаружены ферменты - представители всех известных классов. Они могут пронизывать мембрану насквозь, присутствовать в ней в растворенной форме или, являясь периферическими белками, связываться с мембранными поверхностями в ответ на какой-либо сигнал. Можно выделить следующие характерные типы мембранных ферментов:

1) трансмембранные ферменты, катализирующие сопряженные реакции на противоположных сторонах мембраны. Эти ферменты имеют, как правило, несколько активных центров, размещающихся на противоположных сторонах мембраны. Типичными представителями таких ферментов являются компоненты дыхательной цепи или фотосинтетические редокс-центры, катализирующие окислительно-восстановительные процессы, связанные с транспортом электронов и созданием ионных градиентов на мембране;

2) трансмембранные ферменты, участвующие в транспорте веществ. Транспортные белки, сопрягающие перенос вещества с гидролизом АТР, например, обладают каталитической функцией;

3) ферменты, катализирующие превращение связанных с мембраной субстратов. Эти ферменты участвуют в метаболизме мембранных компонентов: фосфолипидов, гликолипидов, стероидов и др.

4) ферменты, участвующие в превращениях водорастворимых субстратов. С помощью мембран, чаще всего в прикрепленном к ним состоянии, ферменты могут концентрироваться в тех областях мембран, где содержание их субстратов наибольшее. Например, ферменты, гидролизующие белки и крахмал, прикрепляются к мембранам микроворсинок кишечника, что способствует увеличению скорости расщепления этих субстратов.

Белки цитоскелета . Цитоскелет представляет собой сложную сеть белковых волокон разного типа и присутствует только в эукариотических клетках. Цитоскелет обеспечивает механическую опору для плазматической мембраны, может определять форму клетки, а также местоположение органелл и их перемещение при митозе. С участием цитоскелета осуществляются также такие важные для клетки процессы, как эндо- и экзоцитоз, фагоцитоз, амебоидное движение. Таким образом, цитоскелет является динамическим каркасом клетки и определяет ее механику.

Цитоскелет формируется из волокон трех типов:

1) микрофиламенты (диаметр ~ 6 нм). Представляют собой нитевидные органеллы - полимеры глобулярного белка актина и других связанных с ним белков;

2) промежуточные филаменты (диаметр 8- 10 нм). Сформированы кератинами и родственными им белками;

3) микротрубочки (диаметр ~ 23 нм) - длинные трубчатые структуры.

Состоят из глобулярного белка тубулина, субъединицы которого формируют полый цилиндр. Длина микротрубочек может достигать нескольких микрометров в цитоплазме клеток и нескольких миллиметров в аксонах нервов.

Перечисленные структуры цитоскелета пронизывают клетку в разных направлениях и тесно связываются с мембраной, прикрепляясь к ней в некоторых точках. Эти участки мембраны играют важную роль в межклеточных контактах, с их помощью клетки могут прикрепляться к субстрату. Они же играют важную роль в трансмембранном распределении липидов и белков в мембранах.

Образование трансмембранных белков должно включать этапы узнавания трансмембранных доменов и их интеграцию в липидный бислой

Трансмембранные домены выходят из транслокона в латеральном направлении через белок-липидную поверхность раздела

Позиционирование на транслокационном канале и начало переноса секреторных и трансмембранных белков происходят одинаково. Однако транслокация мембранных белков должна сочетаться с их интеграцией или вставкой в липидный бислой ЭПР. Интеграция происходит в тот момент, когда трансмембранные домены узнаются транслоконом, тогда их транслокация в просвет ЭПР прекращается, и они начинают переноситься из канала в липидный бислой в латеральном направлении. Таким путем синтезируются и интегрируются много различных типов трансмембранных белков, включая те, которые пронизывают мембрану несколько раз.

Первым шагом на пути интеграции белка в мембрану является узнавание трансмембранных доменов транслоконом. Эти домены простираются на расстояние около двадцати гидрофобных аминокислот. Из-за своего гидрофобного характера некоторые трансмембранные домены узнаются SRP как сигнальные последовательности. Эти так называемые сигнальные якорные последовательности вначале позиционируют новообразующийся белок на ЭПР, а затем направляются в канал как обычные сигнальные последовательности.

Однако сигнальные якорные последовательности не отщепляются от белка, а интегрируются в мембрану. Как показано на рисунке ниже, в отличие от сигнальной якорной последовательности, большинство трансмембранных доменов узнаются транслоконом, как только они сошли с рибосомы, после завершения адресования с помощью обычной N-терминальной сигнальной последовательности. Информация о том, что трансмембранный домен уже синтезировался, должна передаваться на транслокон другим путем, отличным от переноса с SRP.

Самый простой признак , свидетельствующий о том, что трансмембранный домен находится в транслоконе, это гидрофобность самого домена. Из-за особенности структуры транслокационный канал обнаруживает эту гидрофобность. Как показано на рис. 3.21, структура транслокона предполагает, что канал способен открываться подобно раковине моллюска, что позволяет трансмембранному домену одновременно контактировать с каналом и с липидным бислоем. По-видимому, сигнальные последовательности и трансмембранные домены связываются с белком Sec61a, расположенным со стороны открывающихся створок, и это связывание затем вызывает латеральное открытие канала.

Такая схема предложена на основании экспериментальных данных , согласно которым трансмембранные домены в канале контактируют с Sec61a и . В результате, хотя в составе транслокона находится водный канал, в мембране присутствует достаточно гидрофобных каналов, в которых перемещаемые полипептиды могут попасть в окружение липидов. Следует ожидать, что участки, содержащие полярные аминокислоты, должны продвигаться через канал без остановки, в то время как гидрофобные домены за счет сильного взаимодействия с липидами будут оставаться связанными с боковыми стенками канала, препятствуя транслокации.

В некоторых случаях транслокон может по-другому идентифицировать трансмембранный домен. Например, иногда в процессе синтеза трансмембранного домена изменения во взаимодействии между рибосомой и транслоконом происходят до того момента, как домен сошел с рибосомы. Эти изменения служат для транслокона сигналом о скором появлении трансмембранного домена. Каким образом трансмембранный домен вызывает изменения в рибосоме и передает их транслокону, остается невыясненным. Иногда для узнавания также необходимы полярные элементы новообразующейся цепи, примыкающие к трансмембранному домену. Это позволяет предположить, что, по крайней мере, в некоторых случаях процесс узнавания должен включать нечто большее, чем просто гидрофобное взаимодействие между доменом и канально-липидным окружением.

Граница канала и липидного слоя , по-видимому, служит путем выхода трансмембранных доменов из канала после их узнавания. Однако механизм выхода домена из транслокона несколько варьирует от субстрата к субстрату. Некоторые домены покидают транслокон почти сразу после узнавания их в канале. В этих случаях трансмембранный домен сначала контактирует с Sec61a и с липидами, а затем только с липидами; при этом предполагается, что домен уже проник в липидный бислой.

Для интеграции таких доменов других белков , за исключением комплекса Sec61, не требуется. Другие трансмембранные домены интегрируются более медленно и после узнавания долго не выходят из транслокона, иногда даже оставаясь там до окончания трансляции. По мере выхода из канала в бислой эти трансмембранные домены вступают в контакт с белком TRAM, хотя его дальнейшая роль остается пока неясной.

Степень гидрофобности частично определяет, интегрируется ли трансмембранный домен сразу же, или это происходит на более позднем этапе синтеза белка. Более гидрофобные домены могут быстрее продвигаться в липидный бислой, но менее гидрофобные могут оставаться на границе, и им необходимы дополнительные транспортные факторы. Не исключено, что TRAM и другие белки служат шаперонами для некоторых трансмембранных доменов. Они способствуют интеграции таких доменов, гидрофобность которых оказывается недостаточной для перемещения.

Очевидно, что по крайней мере группа трансмембранных белков может представлять собой множественные формы, содержащие определенный домен, который в одних случаях интегрируется в мембрану, а в других остается неузнанным. Такие белки, как TRAM, могут определять, при каких условиях такие замены будут интегрированы.