Principy strukturní organizace membránových proteinů a metody její predikce pro transmembránové proteiny. membránové procesy. Plazmová membrána Membránové proteiny jsou amfifilní sloučeniny

Pokud je hlavní úlohou lipidů ve složení membrán stabilizovat dvojvrstvu, pak jsou za funkční aktivitu membrán zodpovědné proteiny. Některé z nich zajišťují transport určitých molekul a iontů, jiné jsou enzymy, další se podílejí na vazbě cytoskeletu na extracelulární matrix nebo slouží jako receptory pro hormony, mediátory,

eikosanoidy, lipoproteiny, oxid dusnatý (N0). Proteiny tvoří 30 až 70 % hmoty membrán. Proteiny určují vlastnosti fungování každé membrány.

Strukturální vlastnosti

a lokalizace proteinů v membránách

Membránové proteiny v kontaktu s hydrofobní částí lipidové dvojvrstvy musí být amfifilní. Ty části proteinu, které interagují s uhlovodíkovým řetězcem mastných kyselin, obsahují převážně nepolární aminokyseliny. Oblasti proteinu nacházející se v oblasti polárních „hlaviček“ jsou obohaceny o hydrofilní aminokyselinové zbytky.

Lokalizace proteinů v membránách. Transmembránové proteiny, například: 1 - glykoforin A; 2 - adrenalinový receptor. Povrchové proteiny: 3 - proteiny spojené s integrálními proteiny, například enzym sukcinátdehydrogenáza; 4 - proteiny připojené k polárním "hlavám" lipidové vrstvy, například protein kinae C; 5 - proteiny "ukotvené" v membráně pomocí krátké hydrofobní koncové domény, například cytochromy b 5; 6 - "ukotvené" proteiny kovalentně spojené s membránovým pipidem (například enzym alkalická fosfatáza).

Povrchové proteiny

Povrchové proteiny se často připojují k membráně interakcí s integrálem

proteiny nebo povrchové oblasti lipidové vrstvy.

Proteiny, které tvoří komplexy s integrálními membránovými proteiny

Řada trávicích enzymů zapojených do hydrolýzy škrobu a bílkovin je připojena k integrálním proteinům membrán střevních mikroklků.

Příklady takových komplexů jsou sacharáza-izomaltáza a maltáza-glykoamyláza.

Proteiny spojené s polárními hlavami membránových lipidů

Polární nebo nabité domény molekuly proteinu mohou interagovat s polárními „hlavičkami“ lipidů a vytvářet iontové a vodíkové vazby. Kromě toho se mnoho proteinů rozpustných v cytosolu může za určitých podmínek na krátkou dobu vázat na povrch membrány. Někdy je nezbytnou podmínkou pro projev enzymatické aktivity vazba na bílkoviny. Takové proteiny například zahrnují proteinkinázu C, krevní koagulační faktory.

Kotvení pomocí membránové "kotvy"

„Kotva“ může být nepolární doména proteinu, postavená z aminokyselin s hydro-

fobické radikály. Příkladem takového proteinu je cytochrom b 5 membrány ER. Tento protein se jako nosič elektronů účastní redoxních reakcí.

Roli membránové „kotvy“ může plnit i zbytek mastné kyseliny kovalentně navázaný na protein (myristická – C 14 nebo palmitová – C 16). Proteiny spojené s mastnými kyselinami jsou lokalizovány hlavně na vnitřním povrchu plazmatické membrány. Kyselina myristová se přidává k N-terminálnímu glycinu za vzniku amidové vazby. Kyselina palmitová tvoří thioetherovou vazbu s cysteinem nebo esterovou vazbu se serinovými a threoninovými zbytky.

Malá skupina proteinů může interagovat s vnějším povrchem buňky pomocí fosfatidylinositolglykanu kovalentně připojeného k C-konci proteinu. Tato "kotva" je často jediným spojením mezi proteinem a membránou, proto se působením fosfolipázy C tento protein od membrány oddělí.

Transmembránové (integrální) proteiny

Některé z transmembránových proteinů pronikají membránou jednou (glykoforin), jiné mají několik sekcí (domén), které postupně procházejí dvojvrstvou.

Transmembránové domény pronikající dvojvrstvou mají konformaci a-helixu. Polární aminokyselinové zbytky směřují dovnitř globule, zatímco nepolární jsou v kontaktu s membránovými lipidy. Takové proteiny se nazývají „převrácené“ ve srovnání s proteiny rozpustnými ve vodě, ve kterých je většina hydrofobních aminokyselinových zbytků skryta uvnitř, a ty hydrofilní jsou umístěny na povrchu.

Nabité aminokyselinové radikály v těchto doménách jsou nenabité a protonované (-COOH) nebo deprotonované (-NH2).

Glykosylované proteiny

Povrchové proteiny nebo domény integrálních proteinů umístěné na vnějším povrchu všech membrán jsou téměř vždy glykosylovány. Oligosacharidové zbytky mohou být připojeny přes amidovou skupinu asparaginu nebo hydroxylové skupiny serinu a threoninu.

Oligosacharidové zbytky chrání protein před proteolýzou a účastní se rozpoznávání nebo adheze ligandu.

Laterální difúze proteinů

Některé membránové proteiny se pohybují podél dvojvrstvy (laterální difuze) nebo rotovat kolem osy, kolmé k jejímu povrchu.

Laterální difúze integrálních proteinů v membráně je omezena, je to způsobeno jejich velkou velikostí, interakcí s jinými membránovými proteiny, prvky cytoskeletu nebo extracelulární matrix.

Membránové proteiny se nepohybují z jedné strany membrány na druhou ("flip-flop" skoky), jako fosfolipidy.

Proteiny spojené s polárními hlavami membránových lipidů

Proteiny, které tvoří komplexy s integrálními membránovými proteiny

Povrchové proteiny

Povrchové proteiny se často připojují k membráně interakcí s integrálními proteiny nebo povrchovými oblastmi lipidové vrstvy.

Řada trávicích enzymů zapojených do hydrolýzy škrobu a bílkovin je připojena k integrálním proteinům membrán střevních mikroklků.

Příklady takových komplexů jsou sacharáza-izomaltáza a maltáza-glykoamyláza. Je možné, že spojení těchto trávicích enzymů s membránou umožňuje hydrolyzovat substráty vysokou rychlostí a asimilovat produkty hydrolýzy buňkou.

Polární nebo nabité domény molekuly proteinu mohou interagovat s polárními „hlavičkami“ lipidů a vytvářet iontové a vodíkové vazby. Kromě toho se mnoho proteinů rozpustných v cytosolu může za určitých podmínek na krátkou dobu vázat na povrch membrány. Někdy je nezbytnou podmínkou pro projev enzymatické aktivity vazba na bílkoviny. Takové proteiny například zahrnují proteinkinázu C, krevní koagulační faktory.

Kotvení pomocí membránové "kotvy"

"Kotva" může být nepolární doména proteinu, postavená z aminokyselin s hydrofobními radikály. Příkladem takového proteinu je cytochrom b 5 membrány ER. Tento protein se jako nosič elektronů účastní redoxních reakcí.

Roli membránové „kotvy“ může plnit i zbytek mastné kyseliny kovalentně navázaný na protein (myristická – C 14 nebo palmitová – C 16). Proteiny spojené s mastnými kyselinami jsou lokalizovány hlavně na vnitřním povrchu plazmatické membrány. Kyselina myristová se přidává k N-terminálnímu glycinu za vzniku amidové vazby. Kyselina palmitová tvoří thioetherovou vazbu s cysteinem nebo esterovou vazbu se serinovými a threoninovými zbytky.

Malá skupina proteinů může interagovat s vnějším povrchem buňky pomocí fosfatidylinositolglykanu kovalentně připojeného k C-konci proteinu. Tato "kotva" je často jediným spojením mezi proteinem a membránou, proto se působením fosfolipázy C tento protein od membrány oddělí.

Některé z transmembránových proteinů pronikají membránou jednou (glykoforin), jiné mají několik sekcí (domén), které postupně procházejí dvojvrstvou.

Integrální membránové proteiny obsahující 1 až 12 transmembránových domén. 1- LDL receptor; 2 - GLUT-1 - přenašeč glukózy; 3 - inzulínový receptor; 4 - adrenoreceptor.

Transmembránové domény překlenující dvojvrstvu mají konformaci a-helixu. Polární aminokyselinové zbytky směřují dovnitř globule, zatímco nepolární jsou v kontaktu s membránovými lipidy. Takové proteiny se nazývají „převrácené“ ve srovnání s proteiny rozpustnými ve vodě, ve kterých je většina hydrofobních aminokyselinových zbytků skryta uvnitř a hydrofilní jsou umístěny na povrchu.

Lipidům jsou ve složení membrán přiřazeny především strukturální vlastnosti - vytvářejí dvojvrstvu neboli matrici, ve které jsou umístěny aktivní složky membrány - proteiny. Právě proteiny dodávají různým membránám jejich jedinečnost a poskytují specifické vlastnosti. Četné membránové proteiny plní tyto hlavní funkce: určují přenos látek přes membrány (transportní funkce), provádějí katalýzu, zajišťují procesy foto- a oxidační fosforylace, replikaci DNA, translaci a modifikaci proteinů, příjem a přenos signálu. nervový impuls atd.

Je obvyklé rozdělit membránové proteiny do 2 skupin: integrální(vnitřní) a obvodový(externí). Kritériem pro takovou separaci je stupeň síly vazby proteinu na membránu a v souladu s tím stupeň náročnosti zpracování potřebného k extrakci proteinu z membrány. Periferní proteiny tak mohou být uvolněny do roztoku již při promytí membrán směsí pufrů s nízkou iontovou silou, nízkými hodnotami pH v přítomnosti chelatačních činidel, například ethylendiaminotetraacetátu (EDTA), který váže dvojmocné kationty. Periferní proteiny jsou uvolňovány z membrán za takových mírných podmínek, protože jsou spojeny s lipidovými hlavami nebo s jinými membránovými proteiny slabými elektrostatickými interakcemi nebo hydrofobními interakcemi s lipidovými konci. Naopak integrální proteiny jsou amfifilní molekuly, mají na svém povrchu velké hydrofobní oblasti a nacházejí se uvnitř membrány, proto je k jejich extrakci nutné zničit dvojvrstvu. Pro tyto účely se nejčastěji používají detergenty nebo organická rozpouštědla. Způsoby připojení proteinů k membráně jsou značně rozmanité (obr. 4.8).

Transportní proteiny. Lipidová dvojvrstva je neprostupnou bariérou pro většinu ve vodě rozpustných molekul a iontů a jejich transport přes biomembrány závisí na aktivitě transportních proteinů. Existují dva hlavní typy těchto proteinů: kanály(póry) a dopravci. Kanály jsou membránou procházející tunely, ve kterých jsou vazebná místa transportovaných látek dostupná na obou površích membrány současně. Kanály neprocházejí při přepravě látek žádnými konformačními změnami, jejich konformace se mění pouze při otevírání a zavírání. Nosiče naopak mění svou konformaci při přenosu látek přes membránu. Navíc v každém konkrétním okamžiku je vazebné místo přenesené látky v nosiči dostupné pouze na jednom povrchu membrány.

Kanály lze zase rozdělit do dvou hlavních skupin: napěťově závislé a chemicky regulované. Příkladem napěťově závislého kanálu je Na + kanál, jeho činnost je regulována změnou napětí elektrického pole. Jinými slovy, tyto kanály se otevírají a zavírají v reakci na změnu transmembránový potenciál. Chemicky regulované kanály

otevírají a zavírají v reakci na vazbu specifických chemických činidel. Když se například neurotransmiter naváže na nikotinový acetylcholinový receptor, změní se v otevřenou konformaci a umožní průchod monovalentním kationtům (pododdíl 4.7 této kapitoly). Pojmy "pór" a "kanál" jsou obvykle zaměnitelné, ale někdy jsou chápány jako neselektivní struktury, které rozlišují látky především velikostí a umožňují průchod všem dostatečně malým molekulám. Kanály jsou často označovány jako iontové kanály. Rychlost transportu otevřeným kanálem dosahuje 10 6 - 10 8 iontů za sekundu.

Nosiče lze také rozdělit do 2 skupin: pasivní a aktivní. Pomocí pasivních nosičů je přes membránu transportován jeden druh látek. Pasivní dopravci jsou zapojeni do usnadněná difúze a pouze zvýšit tok látky, prováděný podél elektrochemického gradientu (například přenos glukózy přes membrány erytrocytů). Aktivní nosiče transportují látky přes membránu za cenu energie. Tyto transportní proteiny akumulují látky na jedné straně membrány a přenášejí je proti elektrochemickému gradientu. Rychlost dopravy pomocí nosičů velmi závisí na jejich typu a pohybuje se od 30 do 10 5 s -1. Často se k označení jednotlivých přenašečů používají výrazy "permease", "translocase", které lze považovat za synonyma pojmu "přenašeč".

Enzymatické funkce membránových proteinů. V buněčných membránách funguje celá řada enzymů. Některé z nich jsou lokalizovány v membráně a nacházejí zde vhodné prostředí pro přeměnu hydrofobních sloučenin, jiné se v nich díky účasti membrán nacházejí v přísném pořadí, katalyzují po sobě jdoucí fáze životně důležitých procesů a další potřebují pomoc. lipidů ke stabilizaci jejich konformace a udržení aktivity. V biomembránách byly nalezeny enzymy - zástupci všech známých tříd. Mohou pronikat membránou, být v ní přítomny v rozpuštěné formě nebo se jako periferní proteiny vázat na povrchy membrány v reakci na nějaký signál. Lze rozlišit následující charakteristické typy membránových enzymů:

1) transmembránové enzymy, které katalyzují spřažené reakce na opačných stranách membrány. Tyto enzymy mají zpravidla několik aktivních center umístěných na opačných stranách membrány. Typickými představiteli takových enzymů jsou složky dýchacího řetězce nebo fotosyntetická redoxní centra, která katalyzují redoxní procesy spojené s transportem elektronů a tvorbou iontových gradientů na membráně;

2) transmembránové enzymy podílející se na transportu látek. Transportní proteiny, které spojují přenos látky s hydrolýzou ATP, mají například katalytickou funkci;

3) enzymy, které katalyzují přeměnu substrátů vázaných na membránu. Tyto enzymy se podílejí na metabolismu membránových složek: fosfolipidy, glykolipidy, steroidy atd.

4) enzymy podílející se na přeměně ve vodě rozpustných substrátů. Pomocí membrán, nejčastěji v na ně navázaném stavu, se mohou enzymy koncentrovat v těch oblastech membrán, kde je obsah jejich substrátů největší. Například enzymy, které hydrolyzují proteiny a škrob, se přichytí na membrány střevních mikroklků, což zvyšuje rychlost degradace těchto substrátů.

Proteiny cytoskeletu . Cytoskelet je složitá síť proteinových vláken různých typů a je přítomna pouze v eukaryotických buňkách. Cytoskelet poskytuje mechanickou podporu plazmatické membráně, dokáže určit tvar buňky, stejně jako umístění organel a jejich pohyb během mitózy. Za účasti cytoskeletu se také provádějí tak důležité procesy pro buňku, jako je endo- a exocytóza, fagocytóza a améboidní pohyb. Cytoskelet je tedy dynamickým rámcem buňky a určuje její mechaniku.

Cytoskelet se skládá ze tří typů vláken:

1) mikrovlákna(průměr ~ 6 nm). Jsou to vláknité organely - polymery globulárního proteinu aktinu a dalších proteinů s ním spojených;

2) střední vlákna (průměr 8-10 nm). Tvořeno keratiny a příbuznými proteiny;

3) mikrotubuly(průměr ~ 23 nm) - dlouhé trubkové struktury.

Skládají se z globulárního proteinu tubulin, jehož podjednotky tvoří dutý válec. Délka mikrotubulů může dosáhnout několika mikrometrů v cytoplazmě buněk a několika milimetrů v axonech nervů.

Tyto struktury cytoskeletu pronikají buňkou v různých směrech a jsou úzce spojeny s membránou a v některých bodech se k ní připojují. Tyto úseky membrány hrají důležitou roli v mezibuněčných kontaktech, s jejich pomocí se buňky mohou přichytit k substrátu. Hrají také důležitou roli v transmembránové distribuci lipidů a proteinů v membránách.

Tvorba transmembránových proteinů by měla zahrnovat fáze rozpoznání transmembránových domén a jejich integraci do lipidové dvojvrstvy.

Transmembránové domény opouštějí translokon laterálně přes rozhraní protein-lipid

Umístění na translokačním kanálu a začátek transport sekrečních a transmembránových proteinů dojít stejným způsobem. Translokace membránových proteinů však musí být kombinována s jejich integrací nebo inzercí do ER lipidové dvojvrstvy. K integraci dochází v okamžiku, kdy jsou transmembránové domény rozpoznány translokonem, poté se jejich translokace do lumen ER zastaví a začnou se přenášet z kanálu do lipidové dvojvrstvy v laterálním směru. Tímto způsobem je syntetizováno a integrováno mnoho různých typů transmembránových proteinů, včetně těch, které překlenují membránu vícekrát.

První krok na cestě proteinové integrace do membrány je rozpoznání transmembránových domén translokonem. Tyto domény zahrnují přibližně dvacet hydrofobních aminokyselin. Vzhledem k jejich hydrofobní povaze jsou některé transmembránové domény rozpoznávány SRP jako signální sekvence. Tyto tzv. signální kotevní sekvence nejprve umístí nově vytvořený protein na ER a poté jsou směrovány do kanálu jako normální signální sekvence.

nicméně sekvence ukotvení signálu nejsou odštěpeny z proteinu, ale jsou integrovány do membrány. Jak je znázorněno na obrázku níže, na rozdíl od sekvence ukotvení signálu je většina transmembránových domén rozpoznána translokonem, jakmile opustí ribozom, po dokončení adresování normální N-terminální signální sekvencí. Informace o tom, že transmembránová doména již byla syntetizována, musí být translokonu předána jinou cestou než ze SRP.

Nejjednodušší podepsat, což naznačuje, že transmembránová doména je umístěna v translokonu, jde o hydrofobnost samotné domény. Vzhledem ke zvláštnosti struktury vykazuje translokační kanál tuto hydrofobnost. Jak je znázorněno na Obr. 3.21, struktura translokonu naznačuje, že kanál je schopen se otevřít jako lastura škeble, což umožňuje transmembránové doméně současný kontakt kanálu a lipidové dvojvrstvy. Signální sekvence a transmembránové domény se zřejmě vážou na protein Sec61a umístěný na straně otevíracích chlopní a tato vazba pak způsobuje laterální otevření kanálu.

Toto schéma bylo navrženo na základě experimentálních dat, podle kterého jsou transmembránové domény v kanálu v kontaktu se Sec61a a . Výsledkem je, že ačkoli translokon obsahuje vodný kanál, v membráně je dostatek hydrofobních kanálů, ve kterých mohou translokované polypeptidy vstupovat do lipidového prostředí. Mělo by se očekávat, že oblasti obsahující polární aminokyseliny by se měly pohybovat kanálem bez zastavení, zatímco hydrofobní domény v důsledku silné interakce s lipidy zůstanou spojené s bočními stěnami kanálu, což zabrání translokaci.

V některých případech translocon může jinak identifikovat transmembránovou doménu. Například někdy během syntézy transmembránové domény nastanou změny v interakci mezi ribozomem a translokonem dříve, než doména opustí ribozom. Tyto změny slouží jako signál pro translokon, že se brzy objeví transmembránová doména. Jak transmembránová doména indukuje změny v ribozomu a přenáší je do translokonu, zůstává nejasné. Někdy rozpoznávání také vyžaduje polární prvky nově vytvořeného řetězce sousedícího s transmembránovou doménou. To naznačuje, že alespoň v některých případech musí proces rozpoznávání zahrnovat více než jen hydrofobní interakci mezi doménou a prostředím lipidového kanálu.

Hranice kanálu a lipidové vrstvy Zdá se, že slouží jako cesta pro transmembránové domény opustit kanál poté, co jsou rozpoznány. Mechanismus výstupu domény z translokonu se však poněkud liší od substrátu k substrátu. Některé domény opouštějí translokon téměř okamžitě poté, co byly rozpoznány v kanálu. V těchto případech transmembránová doména nejprve kontaktuje Sec61a a lipidy a poté pouze lipidy; předpokládá se, že doména již pronikla do lipidové dvojvrstvy.

Pro integrace takových domén jiných proteinů, s výjimkou komplexu Sec61, není vyžadován. Ostatní transmembránové domény se integrují pomaleji a po rozpoznání neopouštějí translokon po dlouhou dobu, někdy tam dokonce zůstávají až do konce translace. Jak opouštějí kanál do dvojvrstvy, tyto transmembránové domény přicházejí do kontaktu s proteinem TRAM, ačkoli jeho další role zůstává nejasná.

Stupeň hydrofobnostičástečně určuje, zda se transmembránová doména integruje okamžitě nebo se vyskytuje v pozdější fázi syntézy proteinů. Více hydrofobních domén se může pohybovat rychleji do lipidové dvojvrstvy, ale méně hydrofobní mohou zůstat na hranici a vyžadovat další transportní faktory. Je možné, že TRAM a další proteiny slouží jako chaperony pro některé transmembránové domény. Podporují integraci takových domén, jejichž hydrofobnost je nedostatečná pro pohyb.

Očividně, alespoň skupina transmembránových proteinů může představovat více forem obsahujících specifickou doménu, která je v některých případech integrována do membrány, zatímco v jiných zůstává nerozpoznaná. Proteiny, jako je TRAM, mohou určit, za jakých podmínek budou takové substituce integrovány.