Мутации вирусов. Спонтанные мутации вирусов. Индуцированные мутации вирусов. Проявление мутаций вирусов в фенотипе. Наследственность и изменчивость вирусов Образом чтобы блокировать способность вируса к мутации

Люди умирают из-за эволюции. Порядка 30% смертей, происходящих на земном шаре, можно приписать эволюции простых микроорганизмов, начиная с инфекционных агентов, которые все время нас атакуют, - вирусов, грибов и бактерий - и заканчивая клетками нашего собственного организма, изменения в которых порой приводят к раку.

Одна из самых страшных инфекций - это самый обычный грипп. Ежегодно он уносит около 250 тысяч жизней, а в отдельные годы гораздо больше. Самая масштабная из известных эпидемий гриппа - знаменитая испанка 1918 года, погубившая несколько процентов населения Земли.

Штамм вируса гриппа

Как и любой биологический объект, каждый вирус непрерывно изменяется в результате происходящих в его геноме мутаций. Вирус гриппа - один из довольно быстро изменяющихся вирусов. Одна из причин - то, что его генетическая информация кодируется молекулами РНК, а не ДНК, как, например, наш геном; РНК - легко мутирующая молекула. Другая причина - на вирус непрерывно действует отбор: многие из происходящих в его геноме мутаций оказываются для него «полезными», позволяя эффективнее передаваться, например, между людьми.

Из-за накапливающихся мутаций свойства вируса гриппа постепенно изменяются. Самый заметный для нас результат мутаций - это изменения антигенных свойств вируса, то есть способности клеток нашей иммунной системы узнавать данный штамм. Такие постепенные изменения называются антигенным дрейфом. Сейчас считается, что бо́льшая часть антигенного дрейфа идет в тропических широтах, где у гриппа нет выраженных сезонных эпидемий и он держится на одном уровне в популяции человека круглый год. А вот в Северном и Южном полушариях - соответственно, в декабре–марте и в июне–октябре - каждый год возникают новые эпидемии. Обычно ВОЗ рекомендует новый состав вакцины за полгода до того, как эта вакцина реально начинает использоваться - по той причине, что ее производственный цикл довольно длинный.

Эволюция вируса гриппа

Помимо постепенного антигенного дрейфа, эволюция вируса гриппа характеризуется также антигенными сдвигами - радикальными изменениями свойств вируса, которые обычно связаны с реассортацией. У вируса гриппа геном записан на восьми отдельных сегментах, немного напоминающих человеческие хромосомы. Когда клетка хозяина заражается одновременно двумя вирусными частицами двух разных штаммов, эти сегменты могут перемешаться, и может возникнуть новая вирусная частица с новыми свойствами, состоящая отчасти из сегментов одного родительского штамма и отчасти - другого. Такие реассортантные штаммы часто отличаются по свойствам от родительских штаммов и иногда приводят к большим эпидемиям. Все крупнейшие пандемии ХХ века, о которых мы знаем, - пандемии 50–70-х годов, а также, скорее всего, испанка 1918 года - вызывались, видимо, такими реассортациями, когда штаммы, приходящие из разных видов организмов, например из птиц, свиней, лошадей, перемешивались и давали что-то новое, с чем человеческая иммунная система раньше не сталкивалась.

Предсказание мутации вируса

Предсказуема ли эволюция гриппа? В краткосрочной перспективе - да. Недавние научные работы показывают, что можно отчасти предсказать будущую эволюцию вируса, если знаешь о его предыдущей эволюции. Можно, как любят эволюционисты, построить эволюционное дерево. Причем у обычного вируса гриппа А оно имеет очень характерную форму: это отдельный ствол, от которого отходят коротенькие веточки. Когда вы видите дерево такой формы, вы почти всегда можете быть уверены, что имеете дело с патогеном. Есть одна-единственная линия, которая оказывается эволюционно успешной, и она характеризуется быстрыми изменениями, так что коллективной иммунной системе человечества приходится все время стрелять по движущейся мишени. От нее ответвляются другие линии, которые в конце концов вымирают. Тем не менее некое разнообразие существует постоянно.

Для того чтобы хотя бы примерно понять, глядя на разнообразие текущего года, какой из наблюдаемых в текущем году штаммов даст эпидемию в следующем году, надо смотреть на то, какими мутациями отличаются штаммы друг от друга. Если вирус накопил большое количество мутаций в своих эпитопах, то есть в тех местах своих поверхностных (торчащих наружу) белков, которые «видны» иммунной системе, то, скорее всего, он для иммунной системы будет незаметен, а потому с большой вероятностью эффективен. Наоборот, если у него были какие-то мутации во внутренних генах, то эти мутации с большой вероятностью были вредными - они делают вирус менее приспособленным, и такие линии будут вымирать. Можно построить математическую модель, исходя из числа мутаций в эпитопах и других местах, которая предсказывает будущую эволюционную успешность вируса. Кроме того, можно изучить, насколько данный штамм вируса был эволюционно успешным до сих пор, и экстраполировать это в будущее. Такие подходы имеют ограничения; например, они пока не учитывают взаимодействия между генами. У вируса гриппа 11 генов, и они все друг с другом взаимодействуют довольно сложным образом. При составлении прогнозов такого рода соображения пока обычно опускаются, хотя разные группы, в том числе и наша, показали, что они на самом деле важны. Тем не менее в краткосрочной перспективе они важны.

Предсказывать долгосрочную эволюцию вируса, в том числе антигенные сдвиги, гораздо сложнее. Как минимум для этого надо научиться понимать, какие именно из ныне наблюдаемых штаммов дадут реассортант, который может привести к следующей серьезной эпидемии. Такого рода предсказания мы делать совсем не умеем, потому что здесь очень много привходящих факторов. Здесь важно смотреть, с кем больше взаимодействует человек, важно пытаться предсказывать, какие именно штаммы с большей вероятностью легче «научатся» передаваться от человека к человеку.

Как возникают эпидемии

Эпидемии могут вызывать штаммы, присутствовавшие в популяции раньше. Например, текущая эпидемия 2016 года вызвана вирусом гриппа, впервые замеченным у людей в 2009 году. Однако обычно самые серьезные эпидемии вызываются штаммами, новыми для человека. Чтобы случилась такая эпидемия, должно произойти несколько событий. В каком-то виде животных, с которыми взаимодействует человек, должен возникнуть вариант патогена, способный заражать людей; этот вариант должен передаться человеку; наконец, как правило, он должен приобрести дополнительные мутации, позволяющие ему заражать людей эффективно. Вероятность каждого из этих событий оценить очень сложно, поэтому заранее предсказывать эпидемии мы не умеем.

Свиной грипп H1N1

В этом году около двух третей всех случаев гриппа вызываются пандемическим штаммом H1N1 2009 года, известным под именем «свиной». Этот вирус действительно был, по-видимому, получен человеком от свиней, хотя то же самое верно для многих других вирусов: передача от свиней - это довольно частый механизм возникновения новых штаммов у человека. Отличительное свойство H1N1/09 - его очень интересное происхождение: некоторые его сегменты пришли из птичьего гриппа, некоторые - из свиного, некоторые - из обычного человеческого H3N2, который до сих пор вызывал все инфекции. Плавильным котлом, где все эти сегменты встретились друг с другом, стали свиньи. Сейчас ясно, что смертность от H1N1/09 приблизительно такая же, что и от обычного гриппа, которым мы болели каждый год до этого (хотя тут есть нюансы). Фактически в этом году H1N1/09 стал сезонным гриппом, и возможно, что он останется с нами еще на много лет.

Универсальная вакцина от гриппа

От гриппа существует довольно эффективная вакцина. Но проблема в том, что она все время устаревает, поскольку каждый год вирус эволюционирует, изменяя свои антигенные свойства и становясь снова незнакомым для нашей иммунной системы. Вакцину в результате приходится постоянно обновлять. Каждый год специалисты из Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) рекомендуют всем производителям новый состав так называемой трехвалентной вакцины, перечисляя те три штамма, которые должны быть в нее заложены. Лучше всего трехвалентная вакцина защищает именно от них. Хотя, конечно, существует перекрестный иммунитет, и от штаммов, похожих по антигенным свойствам на эти три штамма, она будет защищать тоже неплохо. Тем не менее прививаться от гриппа нам рекомендуют каждый год, и это правильно. Трехвалентная вакцина этого года включает в себя H1N1/09, так что те, кто прививался осенью, сейчас, скорее всего, в выигрыше. Прививка не гарантирует, что вы не заболеете, но снижает вероятность этого.

Предсказания того, как именно пойдет эволюция гриппа, были бы менее актуальными, если бы мы научились делать универсальную вакцину, защищающую от всех штаммов. Пока такой вакцины нет, хотя несколько кандидатов проходят клинические испытания. Сложность в том, что иммунной системе «видны» как раз те поверхностные белки вируса (гемагглютинин и нейраминидаза), которые вирус легко и безболезненно для себя может изменить. Поэтому вакцинацией трудно объяснить иммунной системе, во что ей, собственно, необходимо целиться.

Искусственный синтез штамма гриппа

Была нашумевшая работа одной группы из Голландии и группы из Японии, где исследователи пытались вручную синтезировать штамм птичьего гриппа, который был бы способен передаваться между млекопитающими. Это им удалось. Их работа считалась этически спорной, потому что все боялись, что синтезированный штамм может «убежать» из лаборатории, что его гены не стоит выкладывать в открытый доступ, потому что кто-нибудь злонамеренно сможет такое синтезировать. Тем не менее теперь мы знаем, какими свойствами может обладать тот штамм птичьего гриппа, который сможет передаться человеку.

Нуклеиновые кислоты вирусов подвержены мутациям, то есть внезапным наследуемым изменениям. Сущность этих процессов заключается в нарушениях генетического кода в виде изменений нуклеотидных последовательностей, их выпадений (делеций), вставок либо перестановок нуклеотидов или пар в одно- и двухнитевых молекулах нуклеиновых кислот. Указанные нарушения могут ограничиваться отдельными нуклеотидами или же распространяться на более значительные участки. У вирусов выделяют спонтанные и индуцированные мутации. Их биологическое значение может быть связано с приобретением или потерей патогенных свойств, а также с приобретением свойств, лишающих их чувствительности к действию защитных механизмов организма-хозяина. Мутации, полностью нарушающие синтез или функцию жизненно важных белков, приводят к утрате способности к репродукции и иначе известны как летальные мутации. В их основе лежат изменения, приводящие к возникновению бессмысленных кодонов (с нарушением синтеза белковой цепочки) либо к появлению вставок или делеций (с глубокими нарушениями генетического кода). Мутации с потерей способности синтезировать определённый белок или с нарушением его функций, что в определённых условиях может привести к утрате способности к репродукции называют условно-летальными.

Спонтанные мутации вирусов

Спонтанные мутации возникают под действием различных естественных мутагенов и встречаются с частотой l:10-8 вирусных частиц. Чаще их можно наблюдать у ретровирусов, что связано с более высокой частотой сбоев в обратной транскрипции.

Индуцированные мутации вирусов

Индуцированные мутации вызывают различные химические агенты и УФ-облучение (у ДНК содержащих вирусов). Принципиальной разницы в перестройке генома, вызванной спонтанны ми или индуцированными мутациями, нет. Принято считать, что применяемые мутагены лиш увеличивают частоту спонтанных мутаций. При классификации вирусных мутаций используют два разных подхода: их разделяют по характеру изменений генотипа или по изменениям фено типа, наступающим в результате мутаций. Изучение изменений генотипа вирусов проводят редко, так как для этого необходимо детальное изучение их геномов. Чаще проводят изучен» фенотипических проявлений мутаций как более доступных для исследований.

Проявление мутаций вирусов в фенотипе

По фенотипическим проявлениям мутации вируса можно разделить на четыре группы.

Мутации , не имеющие фенотического проявления, не изменяют свойств вирусов и их выявляют лишь при специальном анализе.

Мутации , имеющие фенотипическое проявление (например, изменение размеров бляшек, образуемых вирусами в культуре клеток или термостабильность вирусов). Мутации, повышающие или снижающие патогенность, можно разделить на точковые (локализующиеся в индивидуальных генах) и генные (затрагивающие более обширные участки генома).

Вирус гриппа — чемпион мутации
Ежегодно тяжелую форму гриппа переносят от трех до пяти миллионов человек, до 500 тысяч из которых умирают от самого гриппа или его осложнений (по данным ВОЗ ). Прививки от гриппа, конечно, существенно снижают вероятность заболеть. Однако

в отличие от таких болезней, как корь или туберкулез, иммунитет к которым вырабатывается после первого заболевания или прививки и остаётся эффективным в течение всей жизни, гриппом многие болеют практически каждый год.

Эффективность иммунитета определяется тем, насколько успешно иммунная система распознает и обезвреживает источник инфекции — вирус или бактерию. При первом заражении или прививке иммунная система учится вырабатывать антитела — молекулы, которые связываются с вирусными частицами или бактериями и обезвреживают их. Однажды выработав антитела, иммунная система оставляет их «на вооружении» до конца жизни.

Поэтому, если человек заражается той же самой инфекцией повторно, иммунитет срабатывает и инфекция быстро обезвреживается. Именно по такому принципу работают прививки против кори, туберкулёза и других заболеваний. Почему же этот механизм дает сбой с вирусом гриппа и прививаться от гриппа приходится каждый год заново?

Это связано с двумя причинами. Первая — это особенность взаимодействия между нашей иммунной системой и вирусом. Поверхность частиц вируса гриппа покрыта молекулами двух белков, называемых гемагглютинин (HA) и нейраминидаза (NA) (см. рисунок). По типу этих белков классифицируются различные варианты гриппа человека, например, H1N1 (гемагглютинин типа 1, нейраминидаза типа 1). Человеческая иммунная система умеет вырабатывать антитела, которые успешно связываются с этими белками. Проблема заключается в том, что эти антитела довольно «привередливы». Даже небольшие изменения в структуре HA и NA приводят к тому, что антитела теряют способность связываться с ними и обезвреживать вирус.

С точки зрения иммунной системы такие модифицированные варианты уже известного вируса выглядят как совершенно новые инфекции.

Во-вторых, на помощь вирусу приходит чрезвычайно полезное для него (и вредное для нас) свойство — способность быстро эволюционировать. Как и все другие организмы, вирус гриппа подвержен случайным мутациям. Это значит, что генетическая информация вирусов-потомков немного отличается от генетической информации вирусов-родителей. Таким образом, мутации постоянно создаются новые варианты белков HA и NA. Однако в отличие от высших живых организмов и от многих других вирусов грипп видоизменяется очень быстро:

чтобы накопить столько же мутаций, сколько белки млекопитающих накапливают за миллионы лет, вирусу гриппа требуется всего несколько лет или даже месяцев.

Таким образом, эволюцию вируса гриппа мы можем наблюдать буквально в реальном времени.

Некоторые из мутаций гриппа приводят к тому, что иммунная система, «натренированная» на старый штамм, распознаёт мутировавший вирус хуже, чем не мутировавший. В то время как иммунитет эффективно борется с немутировашими вирусами, вирусы-мутанты размножаются и заражают всё большее и большее количество людей. Это классический процесс естественного отбора, открытого Чарльзом Дарвином.

Отбор осуществляет иммунная система, которая, защищая нас, невольно оказывает нам медвежью услугу.

Через некоторое время — как правило, два-три года — старый, не мутировавший штамм (вариант вируса) полностью вымирает, а вирус-мутант становится новым доминирующим штаммом. Иммунная система большинства людей учится справляться и с новым штаммом, и цикл повторяется. Такая «гонка вооружений» между вирусом и иммунной системой продолжается десятилетиями.

Как бороться с гриппом

Как в таком случае бороться с гриппом? Есть несколько способов помочь нашей иммунной системе. Во-первых, создаются противовирусные препараты, например, озельтамивир (известный под торговой маркой «Тамифлю») или амантадин, которые препятствуют воспроизводству вируса внутри клеток. К сожалению, вирусы со временем вырабатывают устойчивость к таким препаратам посредством того же процесса мутаций и естественного отбора:

так, почти весь вирус подтипа H1N1, циркулировавший в 2009 году, оказался устойчив к озельтамивиру («Тамифлю»).

Во-вторых, ученые пытаются научить иммунную систему распознавать менее изменчивые части вируса (об этом писала ).

В-третьих, ученые пытаются предсказать, какой штамм вируса окажется наиболее распространенным в следующем году. Если мы научимся это делать, мы сможем «переобучать» нашу иммунную систему по мере необходимости, заранее делая прививку против того штамма, который будет преобладать в следующем сезоне, и наш иммунитет получит фору в гонке вооружений с вирусом. Собственно,

уже сегодня Всемирная организация здравоохранения обновляет состав вакцины от гриппа каждые полгода.

Однако иногда — раз в несколько лет — преобладающим оказывается не тот штамм, на основе которого разрабатывалась вакцина; в таком случае прививка оказывается менее эффективной. Поэтому точное предсказание штамма, который будет наиболее распространён в следующем году, является одной из важных задач борьбы с гриппом.

Наша группа (Джонатан Душофф, Джошуа Плоткин, Георгий Базыкин и Сергей Кряжимский) занимается изучением эволюции вируса гриппа и других организмов уже несколько лет. Наше сотрудничество началось в Принстонском университете в лаборатории профессора Саймона Левина, чьими аспирантами мы были в разные годы. Нас с самого начала интересовали как практические вопросы (как наиболее эффективно предсказать следующий преобладающий штамм), так и фундаментальные вопросы эволюции, например,

является ли эволюция гриппа направленной или случайной.

Задачей нашего последнего совместного проекта было определить взаимосвязь между мутациями, происходящими в разных частях белков HA и NA. Дело в том, что одна и та же мутация, скажем, в белке HA может иметь очень разные последствия для вируса в зависимости от того, произошли ли мутации в других частях того же белка. Например, мутация А позволяет вирусу стать «невидимым» для иммунной системы только в паре с мутацией Б, в то время как каждая из мутаций сама по себе для вируса бесполезна. Обнаружить такие пары мутаций, называемых эпистатическими, можно, проанализировав статистические закономерности в генетических последовательностях вируса. Это мы и сделали .

Такой анализ стал возможен лишь в последние годы, когда резко упала стоимость «секвенирования», то есть выяснения генетических последовательностей.

Количество генетических последовательностей вируса гриппа, зарегистрированных в базе данных , за последние пять лет выросло более чем в шесть раз и достигает 150 тысяч. Такого количества данных достаточно, чтобы обнаружить эпистатические пары мутаций, которые произошли в вирусе гриппа за последние 100 лет.

Оказывается, количество эпистатических мутаций в гриппе достаточно велико, то есть избежать атаки иммунной системы или обрести невосприимчивость к антивирусному препарату могут, по всей видимости, лишь весьма специфические варианты вируса, которые обзаводятся необходимыми комбинациями мутаций. Например, невосприимчивость к препарату озельтамивир появилась в 2009-м году только у вирусов, обладающих как минимум тремя специфическими мутациями в белке NA.

С практической точки зрения тот факт, что мутации в вирусе гриппа эпистатические, позволяет надеяться, что в ближайшем будущем мы научимся предсказывать последующие мутации по предыдущим. Пока вирус «собирает» все необходимые мутации для успешной комбинации, мы сможем разработать новую вакцину против штамма, обладающего всей комбинацией, который распространится только через несколько месяцев или даже лет.

Чтобы определить успех той или иной мутации в сочетании с другими, необходимо понять, как именно происходит взаимодействие между мутациями

и как они, совместно и по отдельности, влияют на структуру белков HA и NA, а также разобраться, как иммунная система реагирует на модифицированные варианты этих белков. Эти вопросы сейчас активно исследуются, в особенности в группе Джошуа Плоткина в Университете Пенсильвании, с которой мы активно сотрудничаем, а также другими коллективами.

Инструкция

Среди ученых интерес к гриппу вызван, прежде всего, тем, что, не смотря на всю прогрессивность современной медицины, абсолютно эффективного лекарства против этого заболевания не найдено. Как и много лет назад, люди в период болезни используют различные «бабушкины» средства, такие как употребление большого количества жидкости, мед, различные травяные настои и т.д. Да, сегодня существует множество препаратов, способных улучшить иммунитет и общее самочувствие человека, заразившегося гриппом, однако, они не являются абсолютной панацеей. Даже при помощи прививок не всегда удается избежать заражения. Как ни странно, грипп по-прежнему остается «неизведанной территорией» для ученых-медиков.

Возможно, максимально эффективное лекарство до сих пор не найдено из-за постоянной мутации вируса гриппа. Но же это происходит? С точностью ответить на этот вопрос невозможно, но вирус, как и любой другой живой организм в природе, пытается выжить, приспособиться к новым условиям существования. Скорее всего именно это стремление и заставляет вирус гриппа изменяться, приобретать иные, более устойчивые к различным воздействиям формы.

Сегодня ученые выделяют два пути, по которым может идти вирус гриппа в своих мутационных процессах, их называют «антигенный дрейф» и «антигенный сдвиг». Любой организм, который пытается захватить вирус гриппа, начинает оказывать ему всевозможное сопротивление. При этом вырабатываются особые антитела, их задача – ликвидация вируса гриппа и освобождение организма. Однако, вирус гриппа начинает сопротивляться такому нападению, он способен изменять свою структуру для того, чтобы противостоять антителам. В результате такой борьбы и образуются новые, ранее неизвестные формы гриппа. Именно поэтому эти мутационные процессы «антигенные». После мутации антитела, выработанные организмом, для новой формы вируса уже не представляют никакой угрозы. Благодаря этому грипп без труда преодолевает преграды иммунной системы и начинает свою разрушительную деятельность в организме.

Первая разновидность мутации гриппа – «дрейф» происходит отнюдь не сразу, вирус изменяется постепенно, поэтому не представляет особой опасности для организма, обычно иммунная система все-таки справляется с болезнью. Однако, второй вид мутации – «сдвиг» весьма серьезен. Вирус в кротчайшие сроки способен значительно изменить свою структуру, образуя новые генетические комбинации. Именно из-за второго вида мутации появились такие пугающие разновидности гриппа, как «птичий» и «свиной». При подобном резком сдвиге структуры вируса у иммунной системы практически нет шансов в борьбе , так как антитела просто не успевают вырабатываться. В этом случае вирус способен распространяться очень быстро, начинается эпидемия, способная забрать немало человеческих жизней.

Наследственность - это свойство организмов обеспечивать материальную и функциональную преемственность между поколениями, а также обусловливать специфический характер индивидуального развития.

Изменчивость - свойство, противоположное наследственности. Изменчивость вирусов обусловлена мутацией генов, сочетанием их при рекомбинации и различным проявлением признаков, зависящим от внешних условий (модификационная изменчивость).

Генетические признаки (маркеры) вирусов . Все признаки вирусов, информация о которых закодирована в генах, называются генетическими. При этом многие признаки обычно обусловливаются несколькими генами.

Генетические признаки (маркеры) у штаммов определяют после предварительного их клонирования. Все их условно разделяют на основные группы:

• групповые и видовые: тип и морфология нуклеиновой кислоты; тип капсида и количество капсомеров; антигенная специфичность; устойчивость к органическим растворителям и детергентам; наличие фермента нейраминидазы и антигенов хозяина; гемагглютинирующие свойства; патогенность для определенного вида живых чувствительных систем;
• внутриштаммовые: гемагглютинирующая активность; терморезистентность; отношение к УФ-лучам, ингибиторам; характер бляшек и др.

Для проведения генетических исследований наибольшее значение имеют внутривидовые признаки, позволяющие дифференцировать варианты (мутанты, рекомбинанты) между собой.

В большинстве исследований генетические признаки обозначаются начальными буквами латинского алфавита с добавлением знака «+» или «-», т. е. наличие или отсутствие того или иного свойства. Отдельные признаки, например нейровирулентность (N), обозначаются двумя буквами в зависимости от вида животного, на котором проявляется это свойство: нейровирулентность для обезьяны - monN, нейровирулентность для мышей - mN и т. п.

Пока еще трудно унифицировать номенклатуру генетических признаков, поэтому для каждой группы вирусов оправдана специфическая символика их. Однако ряд признаков уже может иметь общие обозначения для всех видов вирусов.

Виды мутации вирусов . Вирусы изменяют свои свойства как в естественных условиях при репродукции, так и в эксперименте. В основе наследственных изменений свойств вирусов лежат два процесса:

• мутация - изменение последовательности нуклеотидов в определенном участке генома вируса, ведущее к изменению фенотипических свойства;
• рекомбинация - обмен генетическим материалом между двумя близкими, но отличающимися по наследственным свойствам вирусами.

Классификация мутаций .

По механизму :

1. деления - выпадение одного или нескольких нуклеотидов;
2. встраивание одного или нескольких нуклеотидов;
3. замена одного нуклеотида другим.

По длине измененной последовательности нуклеотидов :

1) точечная замена одного нуклеотида (PHK-содержащие вирусы) или одной пары комплементарных нуклеотидов (ДНК-содержащие вирусы). Такие мутации могут иногда восстанавливаться (ревертировать) до исходной структуры генома. Не всегда точечные мутации приводят к изменению фенотипа. Одна из основных причин, в силу которых такие мутации могут не проявляться, - это вырожденность генетического кода, т. е. кодирование одной аминокислоты несколькими триплетами. Поэтому структура белка и его биологические свойства не нарушатся. Если аминокислота кодируется только одним триплетом, то в этом случае в белок включается какая-нибудь иная аминокислота, что может привести к появлению мутантного признака;

2) аберрация - замена значительного участка генома. Аберрации у вирусов обусловлены делециями различного числа нуклеотидов: от одной пары до последовательности, которая детерминирует одну или несколько функций вируса.

По обратимости :

1) необратимые (прямые) мутации, при которых изменяется фенотип. Частота таких мутаций у вирусов колеблется в широких пределах. Это зависит от клеточной системы, в которой происходит развитие вирусной популяции. Одновременно клеточная система может являться и фактором селекции. Мутанты, возникающие в популяции, не остаются генетически чистыми линиями, а иногда могут быстро размножаться и практически полностью вытеснить остальные составляющие популяции;

2) обратимые мутации:

истинные реверсии, при которых обратная мутация происходит в месте первичного повреждения; псевдореверсии, при которых мутация происходит в другом участке дефектного гена (интрагенная супрессия мутации) или в другом гене (экстрагенная супрессия мутации). Реверсии не являются редкими событиями, так как измененные организмы обычно более приспособлены к данной клеточной системе.

По природе :

1) спонтанные мутации, которые в живой природе возникают чрезвычайно редко и под влиянием причин, трудно устанавливаемых в каждом отдельном случае. Такие изменения в популяции вирусов возникают без внешнего воздействия. Однородных популяций не бывает, поэтому в вирусной популяции в процессе ее развития спонтанные мутанты возникают с определенной вероятностью. Частота мутаций одного и того же признака может быть различной в зависимости от штамма.

Возникать спонтанные мутации могут в результате (по Уотсону и Крику, 1953):

а) таутомерного превращения (перегруппировок) оснований, входящих в состав нуклеиновой кислоты. Например, таутомерный сдвиг в положении атома водорода у аденина приводит к тому, что аденин при репликации спаривается не с тимином, а с гуанином. При спаривании оснований ошибка приводит в последующих репликациях к замене пары АТ и ГЦ.

Спонтанные мутации, возникшие в одном и том же гене, распределяются по его длине неравномерно. Одни участки гена изменяются часто («горячие» точки), другие - редко. Поэтому вероятность ошибок при спаривании оснований в различных участках гена различна. Это может быть связано с определенной конформацией нуклеиновой кислоты: отдельные нуклеотиды могут с большей степенью вероятности подвергаться таутомерному превращению, чем другие;

б) ошибок в работе ферментов: ДНК- или РНК-полимераз.

Примеры спонтанных мутаций .

1. Природная изменчивость антигенной структуры (гемагглютинина и нейраминидазы) вирусов гриппа человека и животных (в том числе птиц), на примере штаммов типа А2. Исходные штаммы типа А2 не различались между собой по антигенной структуре, тем, агглютинирующей активности, термостабильности, способности репродукции при 40°С и переходу и индикаторное состояние. (Индикаторный вирус - вирус, позволяющий выявить в культуре клеток другой нецитопатогенный вирус.) Позже штаммы, относящиеся к антигенным подгруппам А2/1, А2/2 и А2/3 (выделенные с 1968 по 1970 г.), показали изменение антигенной структуры и других биологических свойств этого возбудителя. Вначале исчезли ингибиторорезистентные штаммы, а затем ингибиторорезистентные варианты из смешанной популяции чувствительных к ингибиторам штаммов.

2. Гемагтлютинин и нейраминидаза вируса гриппа претерпевают изменения, независимые друг от друга. Например, вирус гриппа птиц, выделенный от индеек в штате Висконсин (США), содержал нейраминидазу, антигенно родственную нейраминидазе вирусов гриппа человека А2/Гонконг/68 и не схожий гемагглютинин, тогда как вирус гриппа, выделенный от свиньи на о. Тайвань, содержал антигены гемагглютинина и нейраминидазы, родственные антигенам вируса гриппа человека А2/Гонконг/68.

3. Известно 11 серовариантов вируса ящура (сем. пикорнавирусы) у типа О, 32 сероварианта у типа А, 5 - у типа С, 7 - у типа Sat-1 и по 3 - у типов Sat-2 и Sat-3. Штаммы вируса ящура типа Азия 1 также неоднородны по антигенной структуре.

4. Повышение или ослабление вирулентности возбудителя Изменения могут происходить в короткие сроки, поскольку жизненный цикл вирусов несравненно короче жизненного цикла хозяев. Известно наличие большого числа патогенных вариантов штаммов вируса болезни Ньюкасла (парамиксовирусы). При первом появлении болезнь в Европе протекала остро, с высоким процентом гибели птиц. В настоящее время все чаще регистрируются очаги с низкой летальностью и легким течением болезни. Происходит не только снижение количества очагов, но и аттенуация эпизоотических штаммов, что позволило выделить природно-ослабленные вакцинные штаммы B1, La Sota, F Бор/74/ВГНКИ.

5. Имеются сообщения о выделении природно-ослабленных штаммов вирусов чумы свиней (штамм Мияги), болезни Ауески (штамм Русс), миксомы кроликов и клещевого энцефалита:

2) индуцированные мутации, которые возникают при действии на вирус (вирион или вегетативную форму) различными химическими и физическими мутагенами, а также при адаптации вируса к необычным биологическим системам (адаптационная изменчивость).

После определения наследственных единиц вируса возникла перспектива получения живых вакцинных штаммов непосредственным воздействием на них физическими или химическими мутагенами, вызывающими структурные и функциональные изменения в молекуле вирусной кислоты. Применение искусственных мутагенов имеет два преимущества:

• они вызывают мутации в десятки и сотни раз эффективнее природных факторов;
• действие искусственных мутагенов имеет известную направленность; можно заранее предвидеть, на какие элементы структуры нуклеиновых кислот и каким образом действует тот или иной мутаген и какие изменения в них вызовет.

Химические мутагены . По классификации Фриза (1960) химические мутагены разделяют на две основные группы:

1. мутагены, реагирующие с нуклеиновой кислотой только во время ее репликации (аналоги пуриновых и пиримидиновых оснований);
2. мутагены, реагирующие с покоящейся молекулой нуклеиновой кислоты. Однако для формирования мутаций необходимы последующие репликации молекулы (азотистая кислота, гидроксиламин, алкилирующие соединения).

Молекулярные механизмы мутагенного действия химических соединений подразделяются на две основные группы (по Е. Фризу):

1) замена основания, которая бывает двух типов: а) простая (транзиция), когда на место одного пуринового основания встает другое (например, вместо аденина - гуанин) или одно пиримидиновое основание заменяется другим (цитозин - урацилом). Такие замены происходят при индукции мутаций азотистой кислотой, рядом алкилирующих соединений и гидроксиламином;

б) сложная (трансверсия), при которой вместо одного пуринового основания появляется пиримидиновое или пиримидиновое основание заменяется пуриновым. Трансверсии происходят при индукции мутаций этилэтансульфонатом;

2) выпадение (делеция) или вставка основания, которое ведет к более глубоким изменениям генетического кода, чем простая замена оснований. Мутационные повреждения в одном участке генома нередко приводят к изменению нескольких генетических признаков, имеющих различное фенотипическое проявление (плейотропия). В то же время основой изменения генетического признака, имеющего одно и то же фенотипическое выражение (например, способность размножаться при повышенной температуре), могут быть мутационные повреждения различных генов.

Мутагенное действие аналогов азотистых оснований (5-бромурацил, 5-фторурацил, 5-йодурацил, 2-аминопурин, 2,6-ди-аминопурин) заключается в том, что они индуцируют мутации только при воздействии на реплицирующиеся молекулы ДНК и РНК. Наиболее хорошо изучены 5-бромурацил и 2- аминопурин. Тимин является урацилом, у которого атом водорода (Н) в одной из СН-групп заменен метальной группой (СН 3) - метилурацил. Однако в урациле этот атом водорода можно заменить и другим атомом, например атомом брома (Br). В результате такой замены получается новое соединение - бромурацил, который является аналогом тимина. Структура основного кольца у обоих соединений совершенно одинакова, а различие заключается лишь в одной группе (Br вместо СН 3).

Мутации, индуцируемые алкилирующими соединениями , проявляются простыми (транзиция) и сложными (транверсия) заменами в молекуле нуклеиновой кислоты. Из ДНК удаляются пурины (в основном гуанин), и в зависимости от того, какой нуклеотид встретится напротив бреши при репликации, либо возникает мутация типа замены, либо не возникает ее совсем. К данной группе веществ относятся алкилирующие соединения - иприт и его аналоги, этиленимин и его аналоги - этилметансульфонат и этилэтансульфонат и др. Этилметансульфонат и этилэтансульфонат вызывают алкилирование гуанина и в меньшей степени аденина. Это приводит к гидролизу связи между пуриновым основанием и сахаром и утрате пуринового основания. Мутагенное действие этих соединений было показано с вирусами болезни Ньюкасла и клещевого энцефалита.

Мутагенное действие гидроксиламина заключается в образовании простых замен оснований в молекуле нуклеиновой кислоты (направление зависит от типа нуклеиновой кислоты вируса). У ДНК-содержащих вирусов этот мутаген реагирует исключительно с цитозином. У РНК-содержащих вирусов он вступает в реакцию как с цитозином, так и с урацилом, что обусловливает замены цитозина на урацил и наоборот.

С помощью гидроксиламина были индуцированы мутации у вирусов герпеса, болезни Ньюкасла, полиомиелита. Спонтанные мутанты вируса обычного герпеса (по признаку чувствительности к ингибиторам агара) не способны ревертировать под действием гидроксиламина и, следовательно, обусловлены заменой ГЦ на АТ.

Синтезирован и изучен один из аналогов гидроксиламина - оксиметилгидроксиламин, реагирующий только с цитозином, но не с урацилом РНК, т. е. обладающий более высокой специфичностью и одной направленностью мутагенного действия.

К веществам, химически изменяющим основания в покоящейся молекуле нуклеиновой кислоты, относится также гидразин, который действует только на пиримидиновые основания.

Мутагенное действие интерколирующих агентов заключается в способности соединений встраиваться между витками молекулы ДНК - явление интерколяции. При внедрении акридина между основаниями ДНК изменяется расстояние между ними на 0,34-0,7 нм. Мутагенное действие акридина изучено главным образом на бактериофагах.

У вирусов человека и животных с помощью профлавина индуцированы различные типы мутаций при воздействии на внутриклеточный вирус полиомиелита, клещевого энцефалита и оспы коров. В сочетании с видимым светом красители акридинового ряда обладают выраженным летальным действием на ДНК-содержащие вирусы.

Мутагенным действием обладают нитрозосоединения (N-нитрозометилмочевина, N-нитрозоэтилмочевина, 14-метил-М-1-нитpo-N-нитрозогуанидин) и их производные. При щелочном pH мутагенный эффект нитрозосоединений обусловлен образующимся диазотметаном, а при кислом pH - азотистой кислотой.

Для вирусов человека и животных мутагеном является и формальдегид; были индуцированы мутанты у вируса полиомиелита и вируса западного энцефаломиелита лошадей при воздействии соответственно на очищенную РНК и внутриклеточный вирус. Механизм мутагенного действия формальдегида недостаточно изучен.

Мутагенное действие азотистой кислоты заключается в изменении оснований в покоящейся молекуле нуклеиновой кислоты. Наиболее хорошо изучены азотистая кислота (HNO 2) и гидроксиламин. Азотистая кислота как мутаген дезаминирует органические основания [отщепляет молекулы аминогруппы (NH 2)].

В результате действия азотистой кислоты аденин (А) превращается в гипоксантин (Гк), гуанин (Г) - в ксантин (К), а цитозин (Ц) - в урацил (У). У дезаминированных органических оснований возникают новые свойства.

Физические мутагены . Мутагенное действие повышенной температуры (40-50 °С) обнаружили Е. Фриз на опыте с бактериофагом Т4 и Ю. 3. Гендон при обработке РНК вируса полиомиелита. Температура способствует удалению пуринов (апуринизация, преимущественно гуанина) из ДНК.

При репликации такой ДНК напротив бреши, вызванной утратой пурина, в синтезирующуюся цепь могут быть включены любые нуклеотиды. Если включится основание, которого на этом месте ранее не было, то это означает появление мутации (транзиции или трансверсии).

Мутагенное действие ультрафиолетового излучения . Ультрафиолетовые лучи (УФ) взаимодействуют с молекулами нуклеиновых кислот и «поглощаются» органическими основаниями, особенно при длине волны 260-280 нм. Тимин (Т), урацил (У) и цитозин (Ц) более чувствительны к УФ, чем аденин (А) и гуанин (Г). При облучении структура указанных пиримидинов изменяется; две соседние молекулы тиминов соединяются друг с другом в пары, образуя так называемые тиминовые димеры.

Впервые мутагенное действие УФ-лучей на бактериофаги установили американский ученый Кригер (1958), затем Эльмер и Каплан (1959).

Примеры: мутацию у внеклеточного фага Сд получил А. С. Кривинский, используя метод УФ-воздействия на внутриклеточный вирус, удалось получить мутанты вируса болезни Ньюкасла, отличающиеся от исходного штамма по репродукции в культуре клеток.

Под влиянием УФ-лучей получен мелкобляшечный мутант вируса западного лошадиного энцефаломиелита (WEE), обладающий стабильным S-фенотипом в культуре клеток ФКЭ. Установлена возможность получения мутаций при воздействии УФ-лучей на репродуцирующийся вирус и его нуклеиновую кислоту, в которой происходят структурные нарушения РНК: урацил образует лимеры и гидраты.

Факторов, влияющих на эффективность и направленность мутагенеза, по крайней мере восемь:

1) природа мутагена;

2) специфические особенности вируса. В одинаковых экспериментальных условиях один и тот же мутаген может неодинаково индуцировать мутации у разных вирусов и даже штаммов одного и того же вируса;

3) период взаимодействия вируса с клеткой. Мутации могут возникать при воздействии мутагенами на покоящуюся и вегетативную формы вируса. Во втором случае мутагенный эффект связан не только с возможностью проникновения мутагена в клетку, но и с возможностью возникновения неразрывной связи с репликацией вирусного генома.

На разных этапах репродукции различна чувствительность генетического материала вируса к действию мутагенов, что особенно ярко проявляется у РНК-содержащих вирусов с односпиральным геномом. Например, этиленимин впервые успешно применили для индукции мутаций у вирусов позвоночных при воздействии на репродуцирующуюся популяцию вируса клещевого энцефалита.

Была установлена зависимость летального и мутагенного действий вещества от стадии репродукции вируса: наибольший мутагенный и летальный эффект наблюдали при воздействии этим мутагеном в первые 2 ч латентного периода, т. е. в начальной стадии образования репликативных форм;

4) число репликаций, происходящих у вируса после воздействия на него мутагеном;

5) избирательность взаимодействия мутагена с генами вируса. Эффективность и специфичность действия мутагенов зависят от концентрации мутагена, pH, солевого состава среды и ряда других факторов. Для многих мутагенов обнаружена прямая зависимость между интенсивностью мутагенеза и дозой. Однако с увеличением дозы и усилением мутагенного эффекта снижается и выживаемость вируса. Существует математическая зависимость между величиной, определяющей частоту мутаций, и выживаемостью последнего;

6) условия обработки (pH среды, ее состав, температура);

7) тип клеточной системы;

8) условия культивирования. Индуцированный мутагенез зависит от состава питательной среды, в которой находится система «вирус - клетка». При отсутствии в среде роста тимина происходит более интенсивное включение 5-бромурацила в нуклеиновую кислоту.

Воздействие перечисленных мутагенных факторов на нативный (исходный) вирус менее эффективно, что обусловлено:

• меньшей доступностью вирусной нуклеиновой кислоты воздействию мутагенов, неспособных проникать через белковую оболочку вируса;
• определенным стабилизирующим действием вирусного белка, имеющего тесные внутренние связи с нуклеиновой кислотой.

Стабильность мутантов . Не все мутации, образующиеся под влиянием мутагенов, одинаково стабильны. Различия в стабильности связаны с неодинаковым молекулярным механизмом действий использованных мутагенов. Мутанты, полученные при действии повышенной температуры, кислой среды, УФ-лучей и ультразвуковых волн, дают около 20 % реверсий. Это связано с тем, что они вызывают главным образом локальные изменения вирусной нуклеиновой кислоты, ведущие к замене отдельных оснований. При воздействии профлавина все мутанты оказались полностью стабильными. Причиной мутаций являются выпадения или вставки оснований. При получении вакцинных вирусных штаммов путем воздействия на вирус мутагенами целесообразно использовать мутагены, вызывающие более глубокие изменения генетического кода - типа выпадений или вставок, так как такие мутанты обладают стабильностью наследственных свойств.

Мутации, возникающие при пассажах (адаптации) вирусов . Мутантные популяции вирусов могут возникать и в результате адаптации их к биологическим системам in vitro (культуры клеток) и in vivo (животные, куриные эмбрионы).

Мутации при пассажах на животных . При адаптации вирусов к естественно восприимчивым животным или к гетерогенным тканям экспериментально-восприимчивых животных решающее значение в работе имеют многие факторы:

• свойства вируса и способ его введения. Немалое значение имеют и свойства штамма. Например, разные штаммы вируса уличного бешенства требуют различного числа пассажей для превращения их в штамм фиксированного вируса;
• вид и возраст животного. Значение имеет ослабление резистентности хозяев (воздействие кортизоном, температурой, γ-облучением и т. п.).

Существует много примеров влияния используемого при пассажах вида животного на изменение биологических свойств вируса.

Примеры , которые имели положительный исход в виде получения генетически стабильных безвредных живых вакцин:

1) путем серийных пассажей вируса бешенства (штамм Флюри) через мозг однодневных цыплят и далее в куриных эмбрионах (заражение в желточный мешок) получили вакцинный штамм (virus fixe), который апатогенен для кроликов, мышей и собак (варианты Нер и Lep);

2) многократными пассажами вируса желтой лихорадки через мозг мышей значительно усилились нейротропные свойства вируса для мышей и утратились свойства патогенности для обезьян. После 258-260 пассажей адаптированный вирус с 1939 г. применяют для иммунизации людей против этой инфекции;

3) длительные пассажи вируса чумы крупного рогатого скота через организм коз привели к ослаблению его вирулентности для восприимчивых животных. В 1948 г. был получен аттенуированный вариант вируса, применяемый для вакцинации крупного рогатого скота (штамм Эдварде);

4) аналогичным образом Накамура и Миямато адаптировали к кролику вирус чумы крупного рогатого скота (штамм L), который применяют в качестве высокоэффективной живой вакцины;

5) пассажами на мышах и морских свинках удалось преобразовать висцеротропную природу вируса чумы лошадей в нейротропную и получить безвредные для лошадей вакцинные штаммы;

6) длительные пассажи вируса ящура через организм новорожденных кроликов или мышей привели со временем к аттенуации вируса в отношении крупного рогатого скота. Типовая принадлежность при этом не менялась;

7) в результате серии пассажей вируса гриппа (наиболее изменчивый как в экспериментальных, так и в естественных условиях) на мышах (интраназальное введение), он приобрел высокую патогенность для этих животных и вместе с тем утратил патогенность для человека. У адаптированных к мышам штаммов изменился и ряд других свойств: ингибиторочувствительность, терморезистентность и др. Это свидетельствует о глубоких изменениях наследственности вируса.

Мутации при пассажах на куриных эмбрионах . Наследственная изменчивость вирусов наблюдалась и при пассажах их на куриных эмбрионах. Были получены вакцинные штаммы для профилактики инфекционного бронхита, инфекционного ларинготрахеита птиц, чумы собак, катаральной лихорадки овец (блютанга), чумы крупного рогатого скота, болезни Ньюкасла и др.

Мутации при пассажах в культурах клеток . В культурах клеток и тканей успешно выращиваются и аттенуируются многие вирусы:

• после длительных пассажей в культуре переживающей ткани куриных эмбрионов вирус желтой лихорадки утратил нейротропные и висцеротропные свойства, сохранив иммуногенность. Полученный штамм 17Д успешно используют в качестве живой вакцины;
• получили ряд аттенуированных штаммов вируса полиомиелита (трех типов) путем пассажа в культуре клеток почки обезьян. Вакцина, приготовленная из этих штаммов, безвредна для людей, вызывает напряженный и длительный иммунитет, обеспечивающий невосприимчивость к циркулирующим в природе диким штаммам вируса полиомиелита;
• методом пассажа в сочетании с селекцией в культуре клеток вируса чумы крупного рогатого скота (штамм LIII Накамура) получили аттенуированный ареактогеиный вакцинный штамм ЛТ.

Много сообщений о получении наследственно ослабленных иммуногенных штаммов вируса ящура, инфекционного ринотрахеита, вирусной диареи, миксоматоза кроликов и парагриппа-3 крупного рогатого скота при адаптации к различным видам культур клеток.

Причины возникновения мутаций в процессе адаптации . Изменение свойств вируса в процессе пассажей происходит ступенчато. В первых пассажах обнаруживают главным образом вирионы, изменившие какой-либо один генетический признак. С увеличением числа пассажей в популяции выявляют вирионы, изменившие два и более генетических признака; количество таких частиц постоянно возрастает, и в дальнейшем у подавляющего большинства вирусных частиц наблюдают изменение многих генетических признаков.

В основе механизма наследственной изменчивости вирусной популяции при пассажах лежат два процесса: мутация и селекция. В том и другом процессе важную роль играет внешняя среда, которая является одновременно индуктором мутации и селективным фактором.

Если гетерогенную вирусную популяцию, которая имеет в составе измененные и исходные вирусные частицы, культивировать в обычных условиях, то происходит ее реверсия. Например, как показали исследования с аттенуированным вирусом полиомиелита типа 3, реверсия измененных признаков может быть связана не только с гетерогенностью вирусной популяции, но и с наличием в генетически однородной популяции частиц вируса, обладающих низкой стабильностью наследственных свойств.

Накопилось большое число фактов об изменчивости вируса, вызываемой хозяином (host-controlled variation). Изменения заключаются в том, что клетка влияет на характер синтезируемых в ней компонентов вируса. Такие модификации не затрагивают нуклеотидную последовательность генома вируса. Они описаны у ДНК-содержащих бактериофагов, вируса Сендай, болезни Ньюкасла, гриппа и др. Состав белков, закодированных в геноме вируса, может модифицироваться клеткой-хозяином. Это обусловлено наличием в клетке особых мутагенных форм тРНК с нарушенным соответствием между антикодоном и кодоном соответствующей аминокислоты.

Возможны модификации, вызванные включением в вирусную частицу компонентов клетки-хозяина (главным образом белков и липидов): миксовирусы, парамиксовирусы, оболочка которых представляет собой модифицированную клеточную мембрану. Такая мембрана содержит как клеточные липиды, так и клеточные белки хозяина. Поэтому при смене клетки-хозяина (клеточной системы или вида организмов) в структуре оболочки вируса меняются и клеточные антигены.

Антигенные варианты альфавирусов и флавивирусов связаны с условиями культивирования в различных системах хозяина. Белковые компоненты клеток-хозяев включаются в суперкапсидную оболочку вириона, вызывают изменения его антигенной характеристики.

Таким образом, клетка-хозяин может существенно влиять на фенотип вируса или блокировать (частично или полностью) его репродукцию.

Последствия мутаций :

• изменение фенотипических проявлений в нормальных условиях. Например, увеличивается или уменьшается размер бляшек под агаровым гелем; увеличивается или ослабляется нейровирулентность для определенного вида животных; вирус становится более чувствительным к действию химиотерапевтического агента и т. д. Морфологические или структурные мутации могут касаться размера вириона, первичной структуры вирусных белков, изменения генов, детерминирующих ранние и поздние вирусоспецифические ферменты, обеспечивающие репродукцию вируса;
• летальная мутация, при которой нарушается синтез или функция жизненно важного вирусоспецифического белка, например вирусной полимеразы;
• условно-летальная мутация, при которой вирусоспецифический белок сохраняет свои функции в определенных, оптимальных для него условиях и теряет функции в неблагоприятных условиях. Примером таких мутаций являются температурно-чувствительные (от англ. temperature-sensitive) - ts-мутации, при которых вирус теряет способность размножаться при повышенных температурах (39-42 °С), сохраняя эту способность при обычных температурах выращивания (36-37 °С).

Отбор мутантов . При работе с измененными организмами важно изучить мутационную изменчивость того или иного вируса и отобрать интересующие мутанты. Для отбора определяют физико-химические и биологические свойства мутантов:

• связь между изменением определенного признака (маркера) и вирулентностью (реактогенности, иммуногенности и других свойств вируса) - ковариация генетических признаков у мутантов;
• природу мутантного фенотипа: способность к репродукции в той или иной системе, терморезистентность, гемагглютинирующие, гемолизирующие и другие свойства.

Поскольку в вирусологии исследуют свойства популяции в целом, то для проявления изменения наследственности вируса необходим процесс селекции, т. е. создание таких условий, при которых происходит преимущественное размножение вирусных частиц с измененной наследственностью. В результате вся вирусная популяция будет состоять из однородных генетических мутантных вирионов.

При получении генетически однородной популяции в экспериментальных исследованиях используются следующие методы селекции:

• выделение клонов из одиночных пустул на хорионаллантоисной оболочке куриного эмбриона;
• селекция клонов из бляшек на культуре клеток;
• селекция методом предельных разведений;
• селекция методом избирательной адсорбции и элюции;
• селекция методом пассажей в измененных условиях культивирования.

Для генетического анализа пригодны лишь те признаки, которые легко выявляются, достаточно стабильны и контролируются единичной мутацией. У вирусов животных такие сложные признаки, как патогенность, вирулентность, антигенная структура, контролируются не одним, а многими генами.

В настоящее время отбор мутантов вирусов животных проводится на основе анализа условно-летальных мутаций. Все условнолетальные мутанты данного класса (например, все ts-мутанты) обладают одним общим признаком и фенотипически в большинстве случаев неразличимы. Одной из причин возникновения ts-чувствительности в результате мутации является изменение первичной структуры какого-либо белка, например фермента. Причем это изменение таково, что при пермиссивной температуре фермент работает, а повышение (понижение) температуры изменяет его конформацию сильнее, чем конформацию белка дикого типа, и приводит к отсутствию ферментативной активности у мутантного белка.

Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter .